Peter de Leuw:

Gewinnung und Einsatz multispezifischer Antikörper als Hilfsmittel zur Probenvorbereitung in der Rückstandsanalytik von Penicillinen

Inhalt

Intro

Inhalt

1. Einführung

• 1.1 Einleitung
• 1.2 Eigenschaften der Penicilline
  • 1.2.1 Chemisch-physikalische Eigenschaften der Penicilline
    • 1.2.1.1 Strukturen der Penicilline
    • 1.2.1.2 Chemisch-physikalische Daten
    • 1.2.1.3 Reaktivität und Stabilität
  • 1.2.2 Penicilline als Tierarzneimittel
    • 1.2.2.1 Anwendung und Nutzen
    • 1.2.2.4 Präparate
  • 1.2.4 Stabilität in Lebensmitteln
  • 1.2.5 Rückstände in Lebensmitteln
• 1.3 Lebensmittelrechtliche Beurteilung von Penicillinrückständen
  
• 1.4 Rückstandsanalytik der Penicilline
  • 1.4.1 Strategien zur Rückstandsanalytik
  • 1.4.2 Qualitative Schnelltests
  • 1.4.3 Chemisch-physikalische Verfahren
    • 1.4.3.1 Probenvorbereitung: Extraktion und Extraktreinigung
    • 1.4.3.2 Derivatisierung, Chromatographie und Detektion
  • 1.4.4 Immunaffinitätschromatographie
    • 1.4.4.1 Prinzip der Immunaffinitätschromatographie
    • 1.4.4.2 Antikörper - Bildung und Struktur
    • 1.4.4.3 Anforderungen an das Trägermaterial
    • 1.4.4.4 Aktivierung des Trägermaterials
    • 1.4.4.5 Ungerichtete Immobilisierung
    • 1.4.4.6 Gerichtete Immobilisierung
• 1.5 Immunogensynthese
  • 1.5.1 Immunogene zur Gewinnung von anti-Penicillin-Antikörpern
  • 1.5.2 Methoden zur Kopplung von Haptenen an Trägerproteine
  • 1.5.3 Antikörperquellen
    • 1.5.3.1 Antikörper aus Säugetieren
    • 1.5.3.2 Aviäre Antikörper
• 1.6 Immunisierung der Versuchstiere
• 1.7 Charakterisierung polyklonaler Antikörper
• 1.8 Isolierung von Antikörpern
  • 1.8.1 Antikörper aus Kaninchenserum
  • 1.8.2 Antikörper aus Eidotter
• 1.9 Zielsetzung

2. Immunogensynthese und -analytik

• 2.1 Der Syntheseweg
• 2.2 Synthese von p-Azidobenzoesäure
• 2.3 Synthese von p-Azidobenzoylchlorid
• 2.4 Synthese von p-Azidobenzoylpenicillin
• 2.5 Direkte Kopplung von Azidobenzoesäure an 6-APA
• 2.6 Photochemische Kopplung
• 2.7 Bestimmung der Belegungsdichte
• 2.8 Zusammenstellung der Syntheseergebnisse
  

3. Immunisierung der Versuchstiere

• 3.1 Auswahl der Versuchstiere
• 3.2 Immunisierung der Kaninchen
• 3.3 Immunisierung der Legehennen

4. Charakterisierung, Gewinnung und Reinigung der Antikörper

• 4.1 Allgemeiner Ablauf der Antikörperisolierung
• 4.2 Antikörper aus Kaninchenseren
  • 4.2.1 Charakterisierung der Kaninchenseren
    • 4.2.1.1 Immunblot (Western-Blot)
    • 4.2.1.2 Radioimmunoassay (RIA)
      • 4.2.1.2.1 Bestimmung des Titers
      • 4.2.1.2.2 Ermittlung der Spezifität
  • 4.2.2 Gewinnung der Antikörper aus Kaninchenserum
  • 4.2.3 Immobilisierung der Serumantikörper
    • 4.2.3.1 Immobilisierungsverfahren und Materialien
    • 4.2.3.2 Kapazität der IgG-Säulen
• 4.3 Antikörper aus Eidotter
  • 4.3.1 Charakterisierung der Dotterantikörper
    • 4.3.1.1 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
      • 4.3.1.1.1 Titerentwicklung
      • 4.3.1.1.2 Spezifität der Antikörper
    • 4.3.1.2 Radioimmunoassay
  • 4.3.2 Gewinnung von Immunglobulin Y aus den Eidottern
    • 4.3.2.1 Isolierung der aviären Antikörper
    • 4.3.2.2 Affinitätsreinigung von Immunglobulin Y mittels einer Haptensäule
      • 4.3.2.2.1 Herstellung des Haptensorbens
      • 4.3.2.2.2 Immunaffinitätschromatographie am Haptensorbens
    • 4.3.2.3 Überprüfung der Wirksamkeit der Antikörperreinigung
  • 4.3.3 Immobilisierung der aviären Antikörper
    • 4.3.3.1 Immobilisierungsverfahren und Materialien
    • 4.3.3.2 Kapazität der IgY-Säulen
    • 4.3.3.3 Lebensdauer der IgY-Säulen

5. Einbindung der Immunaffinitätschromatographie in ein on-line-Verfahren für Penicillinrückstände

• 5.1 Charakterisierung der verwendeten Affinitätssäule
• 5.2 Einbindung der Immunaffinitätssäule in ein hochdruckflüssigchromatographisches Verfahren
• 5.3 Nachweis von Penicillinrückständen in Lebensmitteln
  • 5.3.1 Das Dotieren der Matrices
  • 5.3.2 Ermittlung der Reproduzierbarkeit des Bestimmungsverfahrens
  • 5.3.3 Nachweis von Penicillinrückständen in Milch
  • 5.3.4 Nachweis von Penicillinen in Rindermuskel
  • 5.3.5 Nachweis von Penicillinrückständen in Rinderleber

6. Diskussion

• 6.1 Ziel dieser Arbeit
• 6.2 Immunogensynthese
• 6.3 Immunisierung der Tiere und Titerentwicklung
• 6.4 Spezifität der Seren und Dotter
• 6.5 Isolierung und Reinigung der Antikörper
• 6.6 Herstellung und Leistungsfähigkeit der Affinitätssäulen
• 6.7 Analytik von Penicillinrückständen in Lebensmitteln
• 6.8 Vergleich mit bisherigen Methoden
• 6.9 Schlußfolgerungen und Ausblick

7. Zusammenfassungen

• 7.1 Zusammenfassung
• 7.2 Abstract

8. Arbeitsvorschriften

• 8.1 Reagenzien, Lösungsmittel
• 8.2 Lösungen und Puffer
• 8.3 Laborgeräte
  • 8.3.1 Allgemeine Laborgeräte
  • 8.3.2 Technische Laborgeräte
  • 8.3.3 Geräte für die Spektroskopie und Chromatographie
• 8.4 Synthese des 6-APA-Immunogens
  • 8.4.1 Darstellung von p-Azidobenzoesäure
  • 8.4.2 Synthese von p-Azidobenzoylchlorid
  • 8.4.3 Darstellung von p-Azidobenzoylpenicillin
  • 8.4.4 Photochemische Kopplung
• 8.5 Radioimmunoassay zur Titer- und Spezifitätsbestimmung
• 8.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
• 8.7 Immunblot
• 8.8 ELISA (Indirect Antigen Coated Plate (IACP) ELISA)
• 8.9 Isolierung von Immunglobulin G
• 8.10 Isolierung von IgY
• 8.11 Präparation des Haptensorbens
• 8.12 Bestimmung von 6-Aminopenicillansäure
• 8.13 Affinitätsreinigung von Immunglobulin Y
• 8.14 Immobilisierung von Antikörpern an Cyanbromid-Sepharose
• 8.15 Ermittlung der Säulenkapazitäten
• 8.16 Dotieren der Matrices
  • 8.16.1 Dotieren von Milch
  • 8.16.2 Dotieren von Rindermuskel und Rinderleber
• 8.17 Extraktion der Penicilline aus Lebensmitteln
  • 8.17.1 Extraktion der Penicilline aus Milch
  • 8.17.2 Extraktion der Penicilline aus Rindermuskel
  • 8.17.3 Extraktion der Penicilline aus Rinderleber
• 8.18 Immunaffinitätschromatographie von Lebensmittelextrakten

9. Literaturverzeichnis

Anhang I

1. Bestimmung des Molekulargewichtes der Polyethylenglykolfraktion
2. Bestimmung von 6-Aminopenicillansäure
3. Verknüpfung von Immunaffinitätschromatographie und HPLC
4. Programmierung des Dilutors
5. Programmierung des Controllers L-5000

Anhang II

1. Abbildungsverzeichnis
2. Tabellenverzeichnis
3. Abkürzungsverzeichnis
4. Verwendete Hard- und Software

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Die Dissertation wurde am 28. Juni 1996 vom Fachbereich Naturwissenschaften II (Chemie/Biologie) der Bergischen Universität-Gesamthochschule Wuppertal angenommen.

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© Mai 1997

Peter de Leuw , , letzte Aktualisierung: 20.12.2016

http://www.pdeleuw.de/diss/inhalt.html - ausgedruckt am 05.02.2023